­Matériel

Le biologiste peut rechercher une mutation dans un gène, qu'elle soit connue ou pas, mais pour cela, il doit s'agir d'un gène connu.

Le matériel le plus souvent utilisé est l'ADN génomique extrait des chromosomes isolés à partir de lymphocytes périphériques (prise de sang).

L'ARN n'est utilisé qu'exceptionnellement, et l'ADNc que dans des cas particuliers, car il nécessite une biopsie du tissu qui exprime la maladie.

La prise de sang ne se fait pas à jeun.

Méthodes

PCR

Amplification enzymatique in vitro d'un grand nombre de copies du gène qui les intéresse.

Enzymes de restriction

Elles coupent l'ADN en reconnaissant des sites de 4 à 6 nucléotides, et elles sont utiles pour détecter des mutations car celles-ci peuvent abolir ou créer des sites de restriction.

Sondes moléculaires

Fragments de gènes ou d'ADNc rendus simple brin, spécifique de la région intéressée (brin complémentaire) qui va s'hybrider spécifiquement au gène codant pour la protéine.

Electrophorèse

Elle sépare les fragments d'ADN amplifiés pour distinguer leurs différentes tailles.

Séquençage

Détermine le séquence du gène étudié.

Southern blot

Identifie des fragments d'ADN coupés par des enzymes de restriction qui sont hybridés avec des sondes, on alors pourra identifier les fragments de taille différente entre le patient et le témoin.

Northern blot

Méthode identique au Southernblot mais avec de l'ARN.

Stratégies

Analyse directe

Elle recouvre toutes les approches qui visent à rechercher les mutations des gènes. Indirecte recherche les allèles des mutations.

Mutation connue

.Petite taille :PCR pour amplifier en grande quantité, puis action des enzymes de restriction aux sondes spécifiques des allèles (sonde spécifique de la mutation et sonde spécifique de la séquence normale)

.Grande taille :pas de PCR mais plutôt un southern.

Mutation non connue

On effectue une PCR et les produits de PCR sont analysés selon 4 méthodes, dont SSCP (Technique de détection : ce n'est pas de l'identification).

On peut détecter un changement de nucléotide dans le fragment amplifié mais on doit séquencer le fragment qui a une migration électrophorétique anormale pour identifier le gène.

Le problème est de savoir si le changement de nucléotide est la cause de la maladie ou si elle est due au polymorphisme.

Dans le cas où, il provoque un codon stop ou un changement du cadre de lecture, c'est une maladie. Ceci est déterminé par le séquençage des gènes.

Nomenclature des mutations

Pour les acides aminés, il existe une dénomination à une ou trois lettres.

Pour nommer une mutation faux-sens

La lettre de l'acide aminé normal est en premier, puis sa position dans la chaîne protéique (en sachant que le premier acide aminé est la méthionine), et enfin la lettre de l'acide aminé anormal résultant de la mutation :

• R117H correspond à arginine en histidine à la position 117.
• G542X qui correspond à une glycine en stop.

Pour nommer une mutation d'épissage

On donne la position du nucléotide en premier, puis le nucléotide échangé , une flèche et la mutation trouvée dans l'ADNc 1162G>A

.si le site donneur est G en position +1 après le nucléotide 621 :621+1G>T le G s'est transformé en T.

.si mutation de l'accepteur : 622-lG>T car il s'agit d'une numérotation des nucléotides codants de l'ADNc.

Ppour nommer une délétion ou une insertion :

F508del délétion de la phénylalanine 508.sinon, pour des délétions plus importantes on note 6232-6236del ou 6232-6236ATAAG ou 6232-6236del5

409-410insC signifie qu'on a inséré un C entre 409 et 410.

Analyse indirecte

Il s'agit de l'étude de l'allèle que porte le gène muté, grâce à des marqueurs, les microsatellites.

Le SNIPS est un marqueur qui permet lechangement d'un nucléotide par un autre sans changer le site de restriction.

Ceci permet la mise en évidence de la maladie même si le gène touché n'est pas connu.

Il existe deux grands mécanismes :

Il y a aussi un mécanisme spécifique du collagène qui interagit avec de nombreuses autres protéines ; ce sont des mutations dominantes négatives : la molécule de collagène mutée interagit quand même avec sa partenaire normale mais il y aura précipitation de l'ensemble (poison) et il s'agit d'un mécanisme dominant de la mutation (un seul allèle est muté).

Notion de mosaïque : un individu donné a des cellules qui n'ont pas le même matériel génétique (mutation au cours de l'embryogenèse dans une cellule souche qui sera transmise aux descendantes de cette cellule souche).

La conséquence clinique est une érythrodermie congénitale bulleuse.

Cependant, si l'on examine les parents, on pourra voir des lésions minimes, comme une verrue, il faudra prélever sur la lésion pour identifier la mosaïque par rapport aux cellules normales.