Pour l'observation au microscope dans le cas où l'on­ veut faire des préparations durables il est nécessaire de faire subir à l'objet diverses manipulations successives.

Tout d'abord il faut fixer l'objet, c'est-à-dire le traiter de telle sorte qu'il ne puisse plus être altéré dans sa forme par les opérations qui suivront. Cela fait, il s'agit de le rendre transparent s'il est opaque, c'est ce qu'on appelle l'éclaircir. L'examen des objets opaques ne donne en effet que des renseignements très superficiels.

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Fixation. Réactifs fixateurs

Les réactifs fixateurs, quels qu'ils soient, altèrent toujours dans une certaine mesure les objets, mais ils les fixent définitivement, dans l'état, morphologique qu'ils leur donnent.

L'alcool absolu

L'alcool absolu est un des meilleurs agents de fixation. Il est en outre d'un emploi très général. Les tissus végétaux et les tissus animaux plongés frais dans l'alcool absolu employé en grande quantité sont Instantanément privés d'eau et tués dans leur forme. S'ils se contractent parfois, ils reviennent à leur volume primitif dans les opérations suivantes. Beaucoup d'organismes inférieurs animaux ou végétaux, par contre, se rétractent tellement au contact de l'alcool qu'il devient impossible de les observer ensuite convenablement. Il faut alors les fixer seulement après qu'ils ont été endormis, par la cocaïne par exemple (infusoires, etc.), par le chloral, etc., ou lorsqu'ils ont été tués lentement de manière a se conserver en état d'extension. C'est ainsi par exemple que les vers de terre qui se contractent énergiquement au contact de l'alcool pourront être fixés en état d'extension si on les a préalablement fait mourir dans l'eau tiède.

L'acide osmique

L'acide osmique rentre également au nombre des meilleurs agents de fixation, surtout lorsqu'il s'agit d'obtenir la conservation d'organes très délicats, tels que les cils vibratiles des cellules épithéliales ou les cils des zoospores, etc. On évitera en employant ce réactif d'en respirer les vapeurs. L'acide osmique nécessite dans son emploi une certaine habitude si son action est poussée trop loin, il teint très fortement en noir l'objet fixé et le rend tellement opaque qu'il devient impossible de l'examiner au microscope.

Il faut arrêter l'action de l'acide osmique avant que l'objet prenne une teinte foncée. On emploie en général une solution au centième dans l'eau distillée. Pour les fixations d'éléments très délicats il y a avantage a utiliser seulement la vapeur d'acide osmique à laquelle on expose l'objet pendant un temps variable avec son volume.

L'acide chromique

L'acide chromique en solution de 0,1 pour 100 à 1 pour 100 est aussi un fixateur fréquemment employé.

La liqueur de Flemming

La liqueur de Flemming mélange chromoacétoosmique est un réactif précieux parce qu'il est stable et ne se décompose pas a la lumière.

II est particulièrement propre à la fixation des figures karyokinétiques ; en voici la formule :

Acide chromique a 1 pour cent pour 25 volumes.

Acide osmique a 1 pour cent pour 10 volumes.

Acide acétique a 1 pour cent pour 10 volumes.

L'eau 55 volumes.

Les immersions des pièces dans ce liquide ne doivent pas dépasser une demi-heure. On lave à l'eau et on colore à l'hématoxyline ou à une couleur d'aniline.

L'acide chromo-nitrique (liquide de Pérenyl)

L'acide chromo-nitrique (liquide de Pérenyl) est un excellent liquide fixateur qui sert en même temps à décalcifier s'il y a lieu. Sous ce rapport il est d'un avantageux emploi il est composé de la façon suivante

Acide chromique à 0,5 pour cent pour 3 parties

Acide nitrique à 10 pour 100 pour 4 parties

Alcool 3 parties

Les objets, après avoir été traités le temps convenable, sont passés dans l'alcool à 70° puis dans l'alcool à 90° et enfin dans l'alcool absolu.

Certains chlorures, et en particulier le chlorure d'or et le bichlorure de mercure, peuvent être employés avec avantage dans la fixation des tissus animaux. Le chlorure d'or s'emploie en solution dont la richesse peut varier de 0,5 pour 100 à 2 pour 100. Les pièces y sont plongées un temps suffisant pour qu'elles prennent une coloration jaunâtre; elles sont ensuite lavées à l'eau.

Le bichlorure de mercure

Le bichlorure de mercure doit être employé en solutions concentrées dans l'alcool à 50° ou 60°. Il convient spécialement à l'étude des arthropodes. Il a été employé en solutions bouillantes pour fixer des animaux très contractiles (Coralliaires, Planaires). Sa pénétration, est très rapide. Les objets doivent être retirés dès qu'ils ont atteint l'opacité blanchâtre qui démontre que cette pénétration, est complète On lave alors à l'alcool à 70° avec beaucoup de soin.

Décalcification

Lorsque les pièces ont été fixées il peut être nécessaire de les décalcifier si elles renferment de l'os ou des matières calcaires. Nous avons vu que quelques-uns des liquides précités peuvent être employés à la fois pour fixer et pour décalcifier.

Parmi les meilleurs agents propres à la décalcification nous devons mentionner encore les suivants on remarquera que les solutions ne doivent pas avoir un titre trop élevé en acide car elles provoquent dans ce cas un dégagement si abondant de bulles d'acide carbonique que les tissus délicats traversés par ces bulles sont bouleversés et parfois comme dissociés, au grand détriment des recherches. Pour l'étude de l'oreille interne, par exemple, c'est là un des obstacles les plus difficiles à tourner. Au nombre des réactifs propres à décalcifier et qui peuvent d'ailleurs donner aussi une fixation plus ou moins absolue, nous citerons

L'acide chromique à 3 pour 100

L'acide picrique en dissolution saturée dans l'eau. On lave ensuite à l'alcool à 70°. Ce réactif est précieux parce qu'il est très pénétrant.

On peut l'associer à l'acide sulfurique (liquide de Kleineberg)

Eau distillée, 100 volumes,

Acide sulfurique, 2 volumes, mêlez et ajoutez de l'acide picrique jusqu'à saturation ajoutez 3 volumes d'eau (Pour les arthropodes, on emploie la solution non diluée).

Les objets sont par ce mélange plus rapidement fixés que par l'acide picrique seul. Après l'immersion, qui peut être prolongée jusqu'à 24 heures et au-delà, on lave à l'alcool.

L'acide nitrique, à 1 ou 2 pour 100, est encore un bon agent de décalcification; et aussi son mélange d'alcool a 90° et d'acide chlorhydrique dans les proportions de 100 à 3.