La PCR quantitative (qPCR) est un outil puissant particulièrement bien adapté à la mesure des niveaux d'ARNm dans les échantillons cliniques, en particulier ceux dont le nombre de cellules est relativement faible. Toutefois, cette approche présente une mise en garde : il est essentiel de disposer de gènes de référence fiables et exprimés de manière stable pour garantir la reproductibilité et une inférence biologique appropriée.

Dans cette étude, nous avons évalué la stabilité d'expression de six gènes de référence dans des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) et des cellules T CD3+ isolées d'adultes jeunes et âgés (n = 10), après stimulation ex vivo avec un virus de la grippe simulé (non stimulé) ou vivant. Nos gènes inclus : β-actine (ACTB), glyercaldéhyde-3-phostphate déshydrogénase (GAPDH), protéine ribosomale L13a (RPL13a), protéine ribosomale S18 (RPS18), complexe succinate déshydrogénase flavoprotéine sous-unité A (SDHA), et enzyme conjuguant l'ubiquitine E2D2 (UBE2D2).

Résultats

L'expression des gènes de référence varie considérablement en fonction du type de cellule et des conditions de stimulation, mais pas de l'âge. En utilisant la méthode comparative ΔCt, et les logiciels BestKeeper, NormFinder et geNorm publiés précédemment, nous montrons que dans les PBMC et les cellules T, UBE2D2 et RPS18 étaient les gènes de référence les plus stables, suivis par l'ACTB ; cependant, l'expression de UBE2D2 et RPS18 s'est avérée augmenter avec la stimulation virale dans les cellules T isolées, tandis que l'expression de l'ACTB n'a pas changé de manière significative. Aucune différence de stabilité liée à l'âge n'a été observée pour aucun des gènes

Conclusions

Cette étude suggère l'utilisation d'une combinaison d'UBE2D2, de RPS18 et d'ACTB pour l'étude des réponses à la grippe dans les PBMC et les cellules T, bien que l'ACTB seul puisse être le choix le plus optimal si l'on choisit de comparer l'expression du gène cible avant et après la stimulation virale. Les gènes GAPDH et RPL13a se sont avérés être de mauvais gènes de référence et devraient être évités pour les études de cette nature.

Lire la suite en anglais: Reliable reference genes for the quantification of mRNA in human T-cells and PBMCs stimulated with live influenza virus