Les virus sont les entités les plus nombreuses sur Terre et ont également été au centre de nombreux épisodes de l'histoire de l'humanité. Au fur et à mesure que l'étude des virus progresse, le transfert de ces connaissances aux étudiants et aux lycéens se heurte à plusieurs limites. Cette lacune est due à la difficulté de concevoir des leçons pratiques permettant aux étudiants de mieux absorber le contenu, compte tenu des ressources financières et des installations limitées, ainsi qu'à la difficulté d'exploiter les particules virales, en raison de leurs petites dimensions.

Le développement d'outils pour l'enseignement de la virologie est important pour encourager les éducateurs à approfondir les sujets abordés et à les relier aux récentes découvertes. Des découvertes, comme les virus géants à ADN, ont permis d'explorer des aspects des particules virales d'une manière jamais vue auparavant. Associer ces nouvelles découvertes à des techniques déjà explorées par la virologie classique, notamment la visualisation des effets cytopathiques sur les cellules permissives, pourrait représenter une nouvelle façon d'enseigner la virologie. Ce travail visait à développer un kit de microscope à lames qui explore les particules virales géantes et certains aspects de l'interaction des virus animaux avec les lignées cellulaires, dans le but de fournir une approche innovante de l'enseignement de la virologie.

Méthodes

Les lames ont été produites par coloration, avec du cristal violet, de virus géants purifiés et de cellules BSC-40 et Vero infectées par des virus des genres Orthopoxvirus, Flavivirus et Alphavirus. Des lames d'amibes infectées par différentes espèces de virus géants et colorées avec des réactifs hémacolores ont également été produites.

Résultats

La coloration des virus géants a permis de mieux visualiser les particules virales, et cette technique met en évidence la diversité de morphologie et de taille entre elles. La coloration d'Hemacolor a permis de visualiser les usines à virus des amibes, et la coloration des monocouches de cellules BSC-40 et Vero infectées avec du violet cristallin met en évidence les unités formatrices de plaques.

Conclusions

Ce kit a été utilisé dans les cours pratiques de virologie pour le cours de sciences biologiques (UFMG, Brésil), et il sera bientôt disponible à bas prix pour les enseignants des écoles primaires dans les institutions qui disposent de microscopes. Nous espérons que cet outil favorisera un environnement d'apprentissage inspirant.

Les virus sont les entités les plus nombreuses sur Terre, et on les trouve dans la majorité des écosystèmes [1]. Plus d'un siècle après leur découverte, les virus sont souvent reconnus par la population comme des agents pathogènes associés à des maladies et à des épidémies. Ils suscitent la peur et la fascination dès lors qu'ils influencent directement la vie humaine [2]. L'étude des virus est connue sous le nom de virologie ; ce sujet est souvent considéré comme faisant partie de la microbiologie. Dans les premières années, une solide formation dans cette discipline était essentielle pour étudier la médecine et la biologie. La pédagogie de la virologie présente plusieurs limites et défis, notamment un coût monétaire élevé pour les matériaux et les exigences des laboratoires de biosécurité. En outre, les étudiants travaillent avec des matériaux présentant des risques biologiques qui peuvent les mettre en danger, eux et leurs collègues [3].

La petite taille des virus est un obstacle majeur qui limite l'étude de la virologie. C'est pourquoi l'apprentissage de la morphologie virale se limite souvent à des figures de microscopie électronique et à des illustrations schématiques de virus [2]. Cet obstacle est cependant devenu obsolète après la découverte du Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV), le premier virus géant d'amibe décrit [4,5,6]. L'APMV est l'espèce prototype du genre Mimivirus (4) ; il appartient aux grands virus nucléocytoplasmiques à ADN (NCLDV) [7,8,9]. Après la découverte de l'APMV, d'autres virus géants ont été décrits et caractérisés, notamment le cedratvirus (CVG), le pandoravirus (PDV), le kaumoebavirus (KAUV), l'Orpheovirusbrasiliensis (OBRV), le faustovirus (FSTV) et le tupanvirus (TPV) [10,11,12,13,14,15,16,17]. De plus, avec la découverte de virus géants, l'un des paradigmes de la virologie a été rompu, à savoir que les virus sont considérés comme des "organismes filtrables". Ce changement a conduit les chercheurs à penser qu'une partie de la virosphère est piégée dans des filtres et à entamer des recherches sur la prospection et la caractérisation des virus géants [18].

Un autre point clé de la virologie est l'observation des effets cytopathiques (ECP) [19]. Les ECP font référence aux changements structurels dans les cellules hôtes qui sont causés par l'invasion virale. Certains virus provoquent des ECP caractéristiques, et l'observation de ces effets est un outil important pour les virologistes qui s'occupent d'isoler et d'identifier les virus [19, 20]. D'un point de vue éducatif, une myriade d'ECP sont visibles par les étudiants au microscope optique, comme les modifications de la morphologie des cellules, les corps d'inclusion et les plaques de lyse [2, 19, 20]. De nombreux virus animaux importants sur le plan médical montrent ces effets au cours de l'infection [20]. Dans cette étude, nous présentons les ECP des poxvirus (virus de la vaccine [VACV] et virus de la variole des vaches [CPXV]) et des arbovirus (virus de la fièvre jaune [YFV], virus du chikungunya [CHIKV], et virus mayaro [MAYV]) sur des matériaux qui sont sûrs pour une application en classe. En outre, nous avons utilisé un large éventail de préparations virales géantes permettant de visualiser les particules et autres structures virales ainsi que les ECP.

Les activités pratiques en biologie donnent aux élèves l'occasion d'effectuer des travaux scientifiques plutôt que de se contenter d'apprendre. Cette modalité permet à l'éducateur d'élargir les sujets abordés en classe et de les relier aux découvertes récentes [21, 22]. Certaines études soulignent l'importance de combiner les cours théoriques et de laboratoire pour atteindre une compréhension plus profonde et une plus grande satisfaction [23, 24]. Notre objectif dans le présent travail était de développer une manière innovante d'aborder les aspects concrets des effets des particules virales et des cellules hôtes. Cette méthode, d'un point de vue éducatif, combine l'expérience pratique avec un cours de virologie en classe pour permettre à l'instructeur d'élargir les connaissances des étudiants (et les siennes). Ainsi, le but de notre kit "Virus Goes Viral" était d'explorer l'aspect révolutionnaire des virus géants et aussi les aspects classiquement explorés des interactions des virus animaux avec les lignées cellulaires et de les intégrer dans l'étude de la virologie.

Méthodes

Virus et cellules

Les virus TPV, CVG, PDV et Niemeyer (NYMV) ont été propagés individuellement en utilisant Acanthamoeba castellanii (American Type Culture Collection [ATCC] 30010) cultivé à 32 °C dans des flacons de culture cellulaire de 175 cm2 avec 50 ml d'extrait de levure peptonée avec du glucose (PYG) en milieu complété par 25 mg/ml d'amphotéricine B (Fungizone ; Cristalia, São Paulo, Brésil) et 500 U/ml de pénicilline (Schering-Plough, Brésil). Les amibes ont été infectées avec une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01. Les cellules ont été incubées jusqu'à ce que les ECP attendus apparaissent en culture, et le milieu a été recueilli par deux étapes de centrifugation. Les cellules d'A. castellanii et les débris cellulaires ont d'abord été éliminés par centrifugation (400 x g pendant 10 min), et les particules ont été purifiées par centrifugation (36 000 x g pendant 1 h) à travers un coussin de saccharose (40-50%), mises en suspension dans le PAS, et stockées à - 80 °C. Le KAUV, l'OBRV et le FTSV ont été propagés individuellement dans le Vermamoeba vermiformis (ATCC50237) cultivé à 32 °C en milieu PYG avec un MOI de 0,01. Après l'apparition des ECP, les cellules et les surnageants ont été collectés, à l'aide de pipettes sérologiques stériles, stockés dans des tubes coniques stériles, et les virus ont été purifiés par ultracentrifugation avec un coussin de saccharose.

Les cellules BSC-40 (ATCC CRL-2761) et les cellules Vero (ATCC CCL-81) de rein de singe vert africain ont été maintenues dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 à 37 °C dans le milieu essentiel minimum d'Eagle (MEM ; Gibco BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis), complétée par 5 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Cultilab, Brésil), 2.5 μg/mL d'amphotéricine B, 500 U/mL de pénicilline (Cristalia), et 50 μg/mL de streptomycine (Schering-Plough, São Paulo, Brésil).

Le YFV (souche vaccinale 17DD), le MAYV (souche BeAr20290), le CHIKV (génotype ECSA - souche BHI3762/H804917, aimablement fourni par le Dr Maurício Lacerda Nogueira), le VACV groupe I (isolat de l'œil de Caragola I), le VACV groupe II (isolat de l'œil de Caragola II) et le CPXV (souche Brighton Red) ont été multipliés individuellement dans des cellules Vero du MEM qui en contenait 1-2.5 % de FBS, 0,25 μg/mL d'amphotéricine B, 100 U/mL de pénicilline 100 U/mL (Schering-Plough, Brésil), et 100 μg/mL de streptomycine à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 dans une grande bouteille de 175 cm2. Par la suite, pour le YFV, le MAYV et le CHIKV, le surnageant d'infection cellulaire a été transféré dans des tubes et centrifugé à 3 000 x g pendant 5 min. Les surnageants clarifiés issus de ces centrifugations ont été stockés à - 70 °C. Le VACV et le CPXV ont été purifiés sur un gradient de saccharose comme décrit précédemment [25] et stockés à - 70 °C.

Préparation des lames pour la visualisation microscopique

Particules virales

Des aliquotes de virus purifiés ont été diluées au 1:10 (CVG, OBRV, PdV et TPV) ou au 1:20 (NYMV), et 10 μL de la dilution appropriée ont été placés au centre de la lame de verre. Le liquide a été étalé par des mouvements circulaires pour obtenir une goutte d'environ 1 cm de diamètre. La lame a été maintenue à température ambiante jusqu'à ce que le liquide sèche à la surface. Par la suite, le virus a été fixé en ajoutant 200 μL de méthanol au centre de la lame et coloré au cristal violet pendant 15 minutes. Après la coloration, les lames ont été lavées à l'eau courante et séchées à température ambiante. Une fois séchée, la région colorée a été recouverte d'une lamelle de verre de 13 mm et fixée sur la lame avec du baume du Canada (Synth, Brésil).

Usines à virus

Environ 1 million de cellules d'A. castellanii en milieu PYG ont été cultivées dans des flacons de culture cellulaire (25 cm2). Après que les amibes aient adhéré au flacon, le NYMV a été inoculé avec un MOI de 1. Après une infection de 12 heures, les cellules ont été retirées du flacon et centrifugées à 885 x g pendant 10 min et colorées avec des réactifs hémacolores (Renylab, Brésil). Une fois séchée, la région colorée a été recouverte d'une lamelle de verre de 13 mm à l'aide de baume du Canada.

Unités de formation de plaques

Deux lignées cellulaires ont été utilisées pour la visualisation des unités de formation de la plaque virale. Pour le MAYV, le CHIKV et le YFV, des cellules Vero (2 × 105 cellules/puits) ont été plaquées sur des lamelles stériles de 13 mm, cultivées en MEM avec 5% de FBS pendant 24 h, et maintenues à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO2. Le lendemain, les cellules ont été infectées par des virus et observées jusqu'à l'apparition de l'ECP caractéristique (plaques de lyse). Une fois les ECP détectés, les lamelles ont été fixées dans du formaldéhyde (3,7 % v/v) pendant 2 h et colorées en violet cristal. Après la coloration, les lamelles ont été lavées, séchées et fixées sur les lames de verre à l'aide de baume du Canada. Pour les virus des deux groupes VACV et CPXV, la visualisation des plaques de lyse a été effectuée en infectant des cellules BSC-40. La même procédure décrite ci-dessus a été suivie pour préparer cette lame.

Organismes d'inclusion

Les cellules BSC-40 (2 × 105 cellules/puits) ont été plaquées sur des lamelles stériles de 13 mm, cultivées en MEM avec 5% de FBS pendant 24 h, et maintenues à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les cellules ont été infectées par le CPXV (MOI : 10), et une fois les ECP détectés, les lamelles ont été fixées dans du formaldéhyde (3,7% v/v) pendant 2 h et colorées avec la solution riche en éosine du kit hémacolor pendant 10 min. Après la coloration, les lamelles ont été lavées, séchées et fixées sur des lames de verre à l'aide de baume du Canada.

Résultats

Diapositives de visualisation de particules virales

Les lames produites avec les particules virales purifiées colorées au cristal violet ont permis une évaluation simple de la morphologie et des tailles de particules distinctes pour chaque isolat (Fig. 1). Les particules de CVG, OBRV et PDV étaient ovoïdes et mesuraient ~ 1 μm de taille et ~ 0,5 μm de diamètre (Fig. 1). Les particules de NYMV étaient ~ 0,6 μm et semblaient sphériques lorsqu'elles étaient observées au microscope optique. Les particules de TPV étaient grandes et fortement colorées de violet cristallin. Elles semblaient avoir une tête sphérique et une queue cylindrique sous microscopie optique (Fig. 1).

Présentation de différentes particules virales géantes (cedratvirus, pandoravirus, orpheovirus, virus Niemeyer et tupanvirus) et des usines à virus de Niemeyer sous microscopie optique. Visualisation et comparaison de micrographies optiques et électroniques pour la visualisation de la morphologie et des usines virales. Le grossissement total est de 1000x

Diapositives de visualisation d'une usine à virus

Les usines à virus ont été visualisées après avoir coloré les cellules avec le kit hémacolor. La fabrique virale du Mimivirus, comme pour le NYMV, est très identifiable, et était représentée par un halo clair avec un centre violet foncé fortement marqué situé dans le cytoplasme de la cellule (Fig. 1, flèche bleue). Le noyau était coloré en violet foncé (Fig. 1, flèche jaune).

Diapositives de visualisation de l'ECP

Deux lignées cellulaires ont été infectées par des virus différents pour produire des lames d'ECP (Fig. 2 et 3). Les tests sur les cellules BSC-40 ont fourni des plaques de lyse visiblement distinctes après l'infection par différents virus. Le CPXV a généré de grandes plaques circulaires de destruction nette avec des restes de cellules rondes très colorées (Fig. 2). La présence de corps d'inclusion éosinophiliques de type A a également été observée dans les cellules BSC-40 infectées par le CPXV (Fig. 2). Ces corps d'inclusion se présentaient sous la forme de grands cercles roses dans le cytoplasme de la cellule hôte (Fig. 2, flèche noire). Les deux groupes de VACV présentaient un phénotype de plaque distinct ; le groupe I présentait de petites plaques de lyse, tandis que le groupe II présentait de grandes plaques avec des cellules très colorées et étirées qui formaient un réseau (Fig. 2). Les monocouches de cellules Vero présentaient des plaques de lyse générées par l'infection à arbovirus. Le YFV a généré des plaques de lyse de bordure largement indéfinies qui comprenaient de nombreuses cellules étirées (Fig. 3). Le CHIKV présentait de grandes plaques circulaires, tandis que le MAYV présentait de petites plaques de lyse marginales non définies (Fig. 3).

Effets cytopathiques de l'orthopoxvirus dans les cellules BSC-40. Monocouches de cellules infectées ou non par l'orthopoxvirus et colorées au cristal violet. La visualisation du corpuscule d'inclusion dans une cellule infectée colorée à l'éosine est également montrée. Le grossissement total est de 100x

Kit "Le virus devient viral" et matériel pédagogique associé

Les diapositives générées dans les sections précédentes ont été utilisées pour composer le kit "Virus Goes Viral". Le kit comprend un total de 15 lames étiquetées : cinq lames de particules virales, neuf lames CPE et une lame d'usine virale (Fig. 4). Le kit comprend du matériel pédagogique associé sur un CD-ROM, dont un matériel infographique, qui vise à aider à comprendre ce qui est observé (fichier additionnel 3) et également des images modèles à haute résolution de chaque lame et des images CPE de plusieurs virus géants d'A. castellanii et V. vermiformis qui n'ont pas été fixés et colorés sous forme de lames (fichier additionnel 1 : figure S1 et fichier additionnel 2 : figure S2). Ces ECP comprennent : l'arrondissement des cellules pour le CVG, le virus de Marseille, le PDV, le TPV et le KAUV ; l'étirement des cellules pour l'OBRV ; les groupes de cellules pour le TPV ; les plaques de lyse pour le FSTV (Fichier additionnel 1 : Figure S1 et Fichier additionnel 2 : Figure S2). Le kit "Virus Goes Viral" et le matériel qui y est joint englobent 13 espèces virales différentes et 17 effets divers dans les cellules hôtes. Ce kit a été utilisé dans des cours pratiques de virologie pour le cours de sciences biologiques (Universidade Federal de Minas Gerais [UFMG], Brésil). Les étudiants ont semblé très réceptifs à la proposition et beaucoup ont été enthousiasmés par la pratique. Certains ont exprimé leur intérêt pour commencer des recherches sur les virus géants et ont pris contact avec notre laboratoire.

Kit "Le virus devient viral". Le stock de lames du kit qui met en évidence les différentes étiquettes

Discussion

Le domaine de la virologie a une longue et forte histoire d'innovations éducatives. Le véritable défi consiste à développer des initiatives spécifiques qui peuvent être largement mises en œuvre dès le début du programme scolaire ([26], voir tableau 1). La virologie est une matière très importante pour plusieurs cours de premier cycle. Les étudiants des cours de médecine et de biologie doivent apprendre la virologie ; cependant, les coûts et les installations adéquates, notamment les hottes biologiques dans les salles aseptiques, sont souvent des obstacles [3]. Bien que l'apprentissage numérique et d'autres approches des textes ou des cours traditionnels augmentent la réceptivité des étudiants, le matériel pédagogique standard, tel que les lames de référence pour microscope, est une ressource pédagogique inestimable [27, 28]. Deux objectifs principaux nous ont amenés à développer le kit "Virus Goes Viral". Le premier objectif était de favoriser une meilleure compréhension des concepts de base de la virologie chez les étudiants. La réalisation de cet objectif ne nécessite que des installations simples avec un microscope optique ou un ordinateur, et ces mesures sont conformes à la réalité brésilienne.

Le deuxième objectif était d'introduire et de diffuser la connaissance des virus géants auprès des étudiants du secondaire et du premier cycle universitaire. Notre groupe s'est consacré à l'exploration des virus géants et des isolats provenant de différents échantillons, notamment d'eau, de sol, d'eaux usées et d'échantillons cliniques, ainsi que dans des environnements extrêmes, par exemple le permafrost et les lacs de soude [12, 17, 29, 30]. Les virus géants ont amené les biologistes à repenser la nature de la vie. Ces dernières années, les virus géants ont fait l'objet d'une large publicité dans les magazines, les journaux, les blogs, les chaînes de télévision et les plateformes de partage de vidéos ; cette couverture est un exemple important de diffusion scientifique.

Une idée fausse courante dans la population générale est que tous les micro-organismes sont associés à des maladies humaines [31]. L'intégration de virus géants dans les salles de classe représente un moyen d'élargir les connaissances et de dissiper l'idée que les virus sont uniquement des agents pathogènes humains. En effet, les virus géants mettent en évidence le fait que tous les organismes peuvent être infectés par des virus. En outre, les virus géants peuvent représenter des outils pour aider le grand public à comprendre l'importance des micro-organismes, leur biologie évolutive et leur écologie dans l'écosystème, et leur ascendance. Avec ce matériel, nous pensons que l'éducateur peut explorer les aspects révolutionnaires de ces virus et créer un environnement d'apprentissage inspirant. Ce matériel est conçu pour être simple mais utile pour l'enseignement de la virologie. Il peut et doit être associé à d'autres stratégies éducatives, y compris d'autres leçons pratiques, selon le plan de l'éducateur et les ressources de l'institution.

Notre kit couvre 13 espèces virales, y compris les virus vertébrés, les protozoaires et les arbovirus. Cette gamme de modèles viraux illustre pour les élèves la diversité de la virosphère. En outre, les ECP couverts par le kit constituent un point de discussion important avec les étudiants sur les interactions spécifiques entre le virus et l'hôte. Un exemple intéressant d'interactions virus-hôte est le mécanisme du TPV et des amibes [32]. Les cellules infectées par un virus peuvent s'agréger avec des cellules non infectées pour former des grappes qui peuvent augmenter la capacité du TPV [32]. Ces grappes sont présentes dans le matériel attaché au "virus devient viral". Un autre exemple est celui des isolats de VACV qui présentent une diversité biologique permettant de séparer les virus en différents groupes [33]. La souche VACV présente des phénotypes de plaques de taille différente ; par exemple, le groupe II du VACV présente des plaques plus grandes que le groupe I du VACV [33]. Notre kit contient des diapositives avec la différenciation des VACV pour bien faire comprendre aux étudiants que même au sein d'une même espèce virale, il existe des variations.

Conclusion

Nous avons conçu un kit de microscope à lames appelé "Virus Goes Viral" qui explore les particules virales géantes et certains aspects des interactions des virus animaux avec les cellules, dans le but de fournir une approche innovante dans l'enseignement de la virologie. Les diapositives ont été produites par coloration, avec du violet cristal, de virus géants purifiés et de cellules BSC-40 et Vero infectées par des virus des genres Orthopoxvirus, Flavivirus et Alphavirus. Le kit contient une diapositive pour la visualisation de l'usine virale dans des amibes colorées avec le kit hémacolor ainsi que le matériel pédagogique associé sur un CD-ROM, comprenant des images modèles à haute résolution de chaque diapositive et des images CPE de plusieurs virus géants dans A. castellanii et V. vermiformis. Ce kit a été utilisé dans les cours pratiques de virologie pour le cours de sciences biologiques (UFMG, Brésil), et il sera bientôt mis à la disposition des enseignants du primaire dans les établissements qui disposent de microscopes, à un prix modique. Nous espérons que cet outil favorisera un environnement d'apprentissage inspirant sur la virologie.

Lire l'article original en anglais : Virus goes viral: an educational kit for virology classes